clonazione TOPO è un processo di clonazione che utilizza , in generale , 3 ' A residui che sono termodinamicamente instabili e li combina con una DNA polimerasi Taq . Inoltre , il processo utilizza un prodotto di reazione a catena della polimerasi fresca ( PCR ) che deve essere conservato a 4 gradi Celsius . Questa forma di clonazione ottimizza la topoisomerasi I molecola attiva aggiunto alla fine di un vettore lineare . Per eseguire la clonazione di TOPO , un certo protocollo dovrebbe essere seguito . Preparazione

Alcuni passi fondamentali possono essere adottate per accelerare il processo complessivo TOPO clonazione e contribuire a garantire il successo . In primo luogo , tubi di cellule vitali dovrebbero essere immessi sul ghiaccio per mantenere la loro accettabilità . Accanto , il mezzo , la crescita batterica arricchito con sostanze nutritive , cultura super- ottimale ( SOC ) deve essere portato a temperatura ambiente . Le piastre selettive devono poi essere pre - riscaldato a 37 gradi centigradi in modo che siano completamente pronto quando arriva il momento di usarli .
Combinazione di ingredienti

Per iniziare la clonazione processo , una combinazione di 2 microlitri di reazione a catena della polimerasi ( PCR ) del prodotto , 0,5 microlitri di soluzione salina , e 0,5 microlitri di clonazione vettore dovrebbe essere combinata in una provetta da centrifuga da 0,5 ml . Una volta combinati , dovranno essere impostato a temperatura ambiente e ha permesso di incubare per cinque-dieci minuti questi ingredienti . Successivamente, gli ingredienti combinati saranno aggiunti a " Top - 10 cellule chimicamente competenti" in un tubo da 50 microlitri e immessi sul ghiaccio per altri dieci minuti. Dopo questo , le cellule devono essere scioccati di calore a 42 gradi Celsius esattamente e immessi sul ghiaccio per un altro minuto prima di aggiungere 180 microlitri del mezzo SOC . Questa miscela deve quindi essere agitata in senso orizzontale a 200 rpm per un'altra ora a 37 gradi Celsius .
Finali Passi

Una miscela di 50 microlitri e 100 microlitri di ogni reazione devono essere placcato out " su LB + AMP piastre + X - Gal e incubare senza agitazione per una notte a 37 C. " Il giorno successivo i tre colonie bianche da ciascuna reazione deve essere scelto e posizionabile in 4 ml di LB + AMP e lasciato incubare per una notte ad una temperatura di 37 gradi centigradi mentre veniva agitata a 200 rpm . Il passo finale è la mini - preparazione dei plasmidi e in attesa di vedere se il processo ha avuto successo .