Il metodo di riciclaggio enzimatico , per GSH , usa glutatione reduttasi per quantificare GSH . Questo protocollo è specifico per plasma , tessuti o campioni di cellule in coltura. Aggiungere il DTNB reagente ( acido 5 - 5' - dithio -bis - 2 - nitrobenzoico ) per GSH . Il gruppo sulfidrilici in GSH reagisce con il reagente e produce un acido giallo denominato 5 - tio - 2 - nitrobenzoico acido ( TNB ) . Aggiungere glutatione reduttasi alla miscela di acido e GSH riciclare GSH e produrre più acido . In questa procedura , il tasso di produzione di acido è proporzionale alla reazione riciclaggio di GSH ; Pertanto , misurare l' assorbanza dell'acido TNB utilizzando uno spettrofotometro . L'assorbanza fornisce una stima della quantità effettiva di GSH nel campione .
Fegato cellulare glutatione Assay
Questo protocollo analizza la quantità di GSH in epatocarcinoma umano ( cancro al fegato cellule ) . Per condurre questa procedura , utilizzare il metodo colorimetrico per la determinazione GSH per ridurre e ossidare GSH . Ridurre GSH utilizzando 5 - 5' - ditiobis ( acido 2 - nitrobenzoico o DTNB ) per formare il
prodotto colorato acido 2 - nitro - 5 - thiobenzoic e glutatione ossidato ( GSSG ) . Utilizzare glutatione reduttasi per ridurre GSSG per formare di nuovo GSH . Al fine di misurare la quantità di GSH nelle cellule epatiche , leggere il campione a 415 assorbanza cinetica su un lettore per micropiastre .
Cellulare apoptosi
In questo protocollo , GSH viene utilizzato per rilevare apoptosi ( morte ) attraverso la misura della diminuzione ridotta GSH . Una diminuzione della concentrazione di GSH cellulare è un indicatore di morte cellulare . Colorare le cellule with non- verde fluorescente thiolite . Accumula il verde thiolite nel citosol (plasma cellulare) e mitocondri ( potenza ) della cella . Utilizzare un citofluorimetro a 490/520 nanometri di visualizzare la quantità di GSH nelle cellule .
Concentrazione totale di GSH in animali e vegetali Campioni
Misurare la concentrazione di totale GSH sia nella forma ridotta e ossidata in diversi campioni animali e vegetali . Aggiungere il reagente tiolo generale , 5 - 5' - ditiobis [ acido 2 - nitrobenzoico ] . Il reagente tiolo reagisce con GSH per formare 412 nm cromofori , acido 5- thionitrobenzoic ( TNB ) e GS- TNB . Aggiungi glutatione reduttasi e Beta - nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ( NADPH ) per ridurre GS- TNB . Il glutatione pubblicherà anche una seconda molecola TMB e riciclare il GSH . Inoltre , qualsiasi GSH ossidato ( GSSG ) presente nella miscela fromed dalla reazione disolfuro viene ridotto a GSH . Utilizzare un lettore di micropiastre a 405 nanometri a leggere il livello di assorbimento e di indicare la concentrazione totale di GSH .