glutatione o GSH , è un tripeptide non essenziale a base di cisteina , glutammato e glicina . Esso è un potente antiossidante che protegge le cellule e gli organi del corpo dagli effetti nocivi di ROS , o specie reattive dell'ossigeno , che si formano tra ossigeno molecolare come risultato di vari processi metabolici del corpo . Antiossidanti, come glutatione , neutralizzano il ROS e impedire loro di interagire e di danneggiare il DNA e le proteine ​​nelle cellule . Il rapporto tra ossidato e ridotto sotto forma di GSH nel vostro corpo è indicativo del ROS - correlato stress ossidativo nei vostri body.Things che vi serve
siringa
farfalla ago
Centrifuga
sodio eparina
Congelatore
acido solfosalicilico
GSH Reazione Agente
micropiastre
sorgente luminosa
soluzione standard GSH

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1

Pareggio circa 2 ml di sangue tramite venipuntura alla vena anticubetal con una farfalla ago 23 attaccato ad una siringa da 5 ml . Aggiungere il campione per testare provette contenenti eparina sodica e delicatamente invertire il tubo per la miscelazione .
2

Raccogliere i globuli rossi centrifugando il campione a 2.500 giri al minuto per cinque minuti . Congelare e scongelare il campione tre volte per rompere le cellule . Centrifugare la soluzione lisato cellulare per 10 minuti a 12.000 rpm e 4 gradi , e raccogliere il surnatante .
3

Rimuovere la proteina dal campione aggiungendo 5 percento acido solfosalicilico e centrifugazione del campione a 12.000 rpm per cinque minuti a 4 gradi . Conservare il surnatante deproteinati a -112 gradi .
4

Mescolare un agente di rilevamento tiolo , GSH reduttasi , nicotinamide adenina dinucleotide fosfato e tampone in proporzioni indicate dal produttore del kit per rendere la miscela di reazione GSH . L'importo di ciascuna sostanza chimica dipende dal numero di prove che si intende effettuare . Diluire la miscela di reazione GSH nel 5 per cento di acido solfosalicilico per ottenere concentrazioni di 16 , 32 , 63 , 125 , 250 e 500 microlitri .
5

Aggiungere 1 a 10 microlitri di campione di sangue deproteinati nei pozzetti di una micropiastra . Aggiungere diluiti serialmente soluzione standard GSH , che è disponibile in kit di prova , a ciascun pozzetto per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 10 microlitri .
6

Aggiungere 90 microlitri di miscela di reazione GSH apportate al punto 4 per ciascun bene in micropiastra . Mescolare il reagente agitando la piastra per 30 secondi .
7

l'estinzione immediatamente mettendo la lastra sotto luce con lunghezze d'onda di 405 e 415 nanometri . Incubare la piastra per 30 minuti . Prendere letture di assorbanza dopo ogni cinque minuti durante l'incubazione .
8

Diluire 6 millimolare del campione processato con il 5 per cento di acido solfosalicilico e la soluzione trifluromethane sulfonato . Questo rimuoverà tutto il ridotto GSH dalla soluzione . Aggiungi 1-10 micoliters di questa soluzione nei pozzetti di micropiastra e ripetere i passaggi 5 , 6 e 7 . Ciò contribuirà a stimare la quantità di GSH ossidato nel campione .
9

Tracciare l'assorbanza e il campione concentrazioni su un grafico Per avere la curva GSH sia ridotto e glutatione ossidato . Calcolare il rapporto tra le due forme di GSH . Aumento dei livelli ossidativo livelli di GSH indicano stress ossidativo e ROS .