esperimenti in vitro sono quelli condotti fuori di un organismo vivente in una provetta o in un ambiente simile . Gli scienziati possono fare copie di RNA o trascrizioni di un gene in vitro attraverso un processo chiamato trascrizione in vitro . L'enzima che rende il trascritto di RNA basato sul gene è chiamato una RNA polimerasi . Una tale molecola è la polimerasi SP6 . Richiede un tratto di DNA chiamata promotore SP6 per poter funzionare correttamente . Promotori

Un promotore è la regione di DNA legato da un RNA polimerasi per iniziare la trascrizione . La polimerasi SP6 richiede che una sequenza molto specifico sia presente nel promotore allo scopo di impegnare , in modo che quando la polimerasi SP6 è utilizzato per la trascrizione in vitro , il gene deve contenere il promotore SP6 per la trascrizione a verificarsi . La polimerasi SP6 è da un tipo di virus chiamato un batteriofago ; aziende biotech producono questo polimerasi infettando batteri di salmonella fago e successivamente isolare la polimerasi .
Expression

espressione o l'attività basale si riferisce al livello di espressione in assenza di altre molecole che aumentare o diminuire il livello di trascrizione . Attivatori e repressori , per esempio , sono proteine ​​che possono legarsi al promotore o ad altre regioni regolatorie del gene e sia assistere all'assunzione del polimerasi RNA o evitare di legarsi . Induttori sono molecole che aumentano la produzione del prodotto del gene aumentando i livelli di espressione .
SP6

attività basale per il promotore SP6 varierà a seconda delle condizioni di l'esperimento . La considerazione più importante , naturalmente, è come le tue condizioni sperimentali possono influenzare l'attività e come SP6 confronto ad altri sistemi . In generale , SP6 polimerasi e promotori assicurano efficienza inferiori rispetto ai sistemi in vitro di trascrizione T7 e T3 in , anche se in condizioni ideali SP6 è grosso modo paragonabile a questi altri due. Come SP6 , sia T7 e T3 utilizzano un RNA polimerasi dal batteriofago .
Condizioni

La concentrazione di sale e la temperatura sono due fattori importanti nel determinare l'attività basale . SP6 è molto sensibile alla concentrazione di sale , così elevate concentrazioni di sale può ridurre notevolmente la sua attività . Tutto il resto rimanendo uguale , l'espressione è significativamente maggiore a 104 gradi Fahrenheit rispetto a 99 gradi Fahrenheit . Concentrazione Nucleotide è un'altra considerazione importante . Basse concentrazioni possono potenzialmente causare la trascrizione di interrompere prematuramente e di conseguenza diminuire la vostra efficienza . Aumentando la concentrazione nucleotide eviterà questo problema . Se stai sintetizzare sonde di RNA , tuttavia , aggiungere troppo nucleotide non marcato diminuirà la quantità di nucleotide marcato nel prodotto finale .